Come funzionava? Il gRNA combina due molecole, crRNA e tracrRNA, e contiene una sequenza complementare a quella del DNA da correggere. Quando l'RNA guida e Cas9 vengono introdotti in una cellula, interagiscono con la sequenza “bersaglio” e la correggono, ad esempio rimuovendo o aggiungendo materiale genetico.

Tuttavia, questo metodo può comportare alcune potenziali complicazioni:

• Le cellule devono essere suscettibili alla trasfezione o alla trasduzione virale
• È necessario scegliere promotori appropriati sia per l'espressione di Cas9 che per quella di gRNA
• Il DNA plasmidico può essere incorporato nel genoma
• Possono verificarsi effetti off-target a causa dell'espressione prolungata di Cas9
• La necessità di trascrizione e traduzione di Cas9 ritarda l'editing. [1]

Invece, l'approccio diverso che consiste nel somministrare direttamente la proteina Cas e il gRNA come complesso ribonucleoproteico (RNP) si è dimostrato un metodo efficiente che offre diversi vantaggi rispetto ai vettori di espressione plasmidica. I complessi RNP, infatti, garantiscono un editing off-target inferiore perché vengono somministrati direttamente alle cellule come complessi attivi per un editing on-target elevato, ma non persistono nelle cellule aumentando il rischio di editing off-target.

IDT (Integrated DNA Technology), leader mondiale nella produzione di oligonucleotidi e nell'editing genetico CRISPR, è un ottimo alleato per i vostri esperimenti CRISPR poiché fornisce componenti RNP, strumenti e reagenti precisi per garantire il successo delle vostre ricerche.

Analizziamo ora in dettaglio quali sono i vantaggi dell'RNP rispetto alla somministrazione di enzimi Cas e gRNA tramite plasmide:

L'editing genomico con plasmide è laborioso

IDT fornisce componenti RNP pronti per la trasfezione che semplificano il processo, altrimenti molto laborioso: con il metodo di somministrazione tramite plasmide è necessario costruire vettori di espressione, trasformare i batteri, selezionare più cloni, isolare il DNA, eseguire digestioni con enzimi di restrizione per identificare i cloni positivi e sequenziare i cloni positivi per confermare le loro sequenze

La somministrazione di plasmidi è intrinsecamente incoerente

L'efficienza di trasfezione varia da una linea cellulare all'altra e persino da un esperimento all'altro. La somministrazione di plasmidi è particolarmente problematica per le linee cellulari “difficili da trasfettare”, come le cellule primarie, con conseguente editing inefficiente. Il complesso RNP può essere consegnato alle cellule con elevata efficienza tramite lipofecondazione o elettroporazione, con conseguente editing potente

I plasmidi lasciano tracce molecolariI ricercatori hanno dimostrato che quando i gRNA vengono introdotti come plasmidi di espressione, nel genoma vengono inseriti non solo basi multiple, ma anche grandi frammenti di vettori plasmidici. La consegna del complesso RNP produce un minor numero di inserzioni di basi multiple ed evita i problemi legati all'impronta molecolare del vettoreL'espressione di lunga durata dei vettori plasmidici aumenta l'editing fuori bersaglioL'espressione guidata dai plasmidi continua per lungo tempo, aumentando significativamente l'editing fuori bersaglio. Al contrario, il trasferimento di RNP produce una reazione “fast on, fast off” che aumenta la precisione di targeting e riduce la possibilità di editing fuori bersaglio. I Cas9 RNP sono infatti rilevabili a livelli elevati poco dopo la trasfezione e vengono rapidamente eliminati dalla cellula attraverso i percorsi di degradazione delle proteine.

Per concludere, nei casi di somministrazione di DNA e RNA, poiché uno o entrambi i componenti CRISPR sono prodotti dal meccanismo cellulare, il risultato è un inevitabile ritardo tra la disponibilità di gRNA e Cas9. La somministrazione di RNP rappresenta attualmente la strategia più diretta per introdurre nelle cellule il sistema CRISPR/Cas9 preassemblato e immediatamente funzionante, che generalmente garantisce una maggiore efficienza di editing genomico rispetto agli altri formati biomolecolari.[2]

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Citazioni:

[1] A., Hempstead, CRISPR 101: Ribonucleoprotein (RNP) Delivery, Addgene Blog, https://blog.addgene.org/crispr-101-ribonucleoprotein-rnp-delivery [Accessed on 6 February 2025]

[2] Y., Lin, E., Wagner and U., Lächelt, Non-viral delivery of the CRISPR/Cas system: DNA versus RNA versus RNP, Biomater. Sci., 2022, 10, 1166-1192, DOI: 10.1039/D1BM01658J