L'interferenza RNA (RNAi) è un processo di silenziamento genico che agisce sull'mRNA, riducendo così l'espressione proteica. I principali substrati RNAi che regolano questo processo sono shRNA, siRNA e miRNA.
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Caratteristiche principali:
Strumenti di interferenza dell'RNA (RNAi) per il silenziamento genico:
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Esperimento di doppio knockdown genico.
Caratteristiche e vantaggi:
Panoramica:
L'interferenza dell'RNA è un percorso conservato comune alle piante e ai mammiferi in cui gli RNA a doppio filamento (dsRNA) sopprimono l'espressione dei geni con sequenze complementari [1-2]. L'RNAi è stato osservato per la prima volta in organismi inferiori, come piante o nematodi. In questi sistemi, i dsRNA lunghi fungono da efficaci trigger dell'RNAi. I dsRNA lunghi non sono i veri e propri trigger, ma vengono degradati dall'endoribonucleasi Dicer in piccole molecole effettrici chiamate siRNA (piccoli RNA interferenti). Gli siRNA hanno solitamente una lunghezza di circa 21 basi con un duplex centrale di 19 bp e 2 basi 3′-overhang. Nei mammiferi, l'elaborazione di Dicer avviene come complesso con la proteina TRBP che lega l'RNA. Il siRNA nascente si associa a Dicer, TRBP e Ago2 per formare il complesso di silenziamento indotto dall'RNA, o RISC, che media il silenziamento genico [3]. Una volta nel RISC, un filamento del siRNA (il filamento passeggero) viene degradato o scartato, mentre l'altro filamento (il filamento guida) rimane per dirigere la specificità di sequenza del complesso di silenziamento. Il componente Ago2 del RISC è una ribonucleasi che scinde un RNA bersaglio sotto la direzione del filamento guida. Di seguito è riportata una panoramica schematica dei percorsi coinvolti nell'RNAi degradativo.
Sebbene i dsRNA lunghi (diverse centinaia di bp) siano comunemente impiegati per innescare l'RNAi in C. elegans o D. melanogaster, queste molecole attivano il sistema immunitario innato e innescano risposte interferoniche (IFN) negli organismi superiori. L'RNAi può essere eseguito nelle cellule dei mammiferi utilizzando RNA corti, che generalmente non inducono risposte IFN. Molti ricercatori oggi utilizzano duplex di RNA sintetici a 21 mer come reagenti RNAi, che imitano gli siRNA naturali risultanti dall'elaborazione Dicer di RNA substrato lunghi. Un approccio alternativo consiste nell'utilizzare duplex di RNA sintetici di lunghezza superiore a 21 mer, che sono substrati per Dicer.
Gli oligonucleotidi antisenso sono utilizzati da oltre venticinque anni per inibire i livelli di espressione genica sia in vitro che in vivo. I recenti miglioramenti nella progettazione e nella chimica dei composti antisenso hanno permesso a questa tecnologia di diventare uno strumento di uso comune nella ricerca di base, nella genomica, nella validazione dei target e nella scoperta di farmaci. Sta diventando sempre più popolare confermare i fenotipi osservati utilizzando l'RNAi mediante oligonucleotidi antisenso che silenziano i geni. Una sequenza di acido nucleico, solitamente lunga 18-25 basi, viene progettata in orientamento antisenso rispetto all'mRNA di interesse; la sequenza viene realizzata come oligonucleotide sintetico e introdotta nella cellula o nell'organismo. L'ibridazione dell'oligo antisenso con l'mRNA bersaglio provoca la scissione del messaggio da parte della RNasi H, che impedisce la traduzione delle proteine e quindi blocca l'espressione genica. Gli oligonucleotidi antisenso contenenti un segmento di DNA nativo o modificato con fosforotioato di almeno sei basi di lunghezza si legheranno all'mRNA bersaglio e formeranno un eteroduplex RNA/DNA, che è un substrato per le RNasi H cellulari endogene [1-2]. La diminuzione dei livelli di mRNA può essere misurata utilizzando la PCR in tempo reale.
Sebbene gli oligodeossinucleotidi non modificati possano mostrare una certa attività antisenso, sono soggetti a una rapida degradazione da parte delle nucleasi e hanno quindi un'utilità limitata. La chimica resistente alle nucleasi più semplice e più utilizzata per le applicazioni antisenso è la modifica fosforotioato (PS). Nei fosforotioati, un atomo di zolfo sostituisce un atomo di ossigeno non ponte nella catena fosfato dell'oligo. Nel sistema di ordinazione IDT, un asterisco indica la presenza di un legame internucleosidico fosforotioato. Gli oligo PS possono mostrare un legame proteico non specifico maggiore rispetto agli oligo fosfodiestere (PO) non modificati, che possono causare tossicità o altri artefatti quando presenti in concentrazioni elevate. Questi problemi sembrano essere più gravi con il PS-DNA e le chimere PS-DNA/LNA. Il legame proteico non specifico degli oligonucleotidi PS può essere ridotto al minimo rendendo l'oligonucleotide il più corto possibile (riducendo così il contenuto di PS) o utilizzando design chimerici con RNA 2'-O-metilico.
Il design antisenso all'avanguardia impiega chimere che contengono sia basi di DNA che di RNA modificato. L'uso di RNA modificato, come l'RNA 2′-O-metilico (2'OMe) o gli LNA (Exiqon) nei design antisenso chimerici, aumenta sia la stabilità nucleasica che l'affinità (Tm) dell'oligo antisenso all'mRNA bersaglio [3-5]. Queste modifiche, tuttavia, non attivano la scissione dell'RNasi H. Il design antisenso preferito incorpora RNA modificato 2′-O o LNA in oligonucleotidi antisenso chimerici che mantengono un dominio di attivazione RNasi H del DNA (o DNA fosforotioato). Poiché le basi LNA conferiscono una significativa resistenza alle nucleasi, si consiglia la modifica fosforotioata solo del gap del DNA, lasciando i fianchi LNA come legami fosfodiestere negli oligonucleotidi antisenso LNA chimerici. Per motivi di sintesi, è preferibile un fosfato 3′ quando una base LNA si trova all'estremità 3′.
Può anche essere utile sostituire il dC con il 5-metil-dC nel contesto dei motivi CpG. La sostituzione del dC con il 5-metil-dC aumenterà leggermente la Tm dell'oligonucleotide antisenso. L'uso di 5-metil dC nei motivi CpG può anche ridurre la possibilità di risposte immunitarie avverse in vivo. IDT raccomanda che tutti gli oligonucleotidi antisenso siano sottoposti a purificazione HPLC e che gli oligonucleotidi siano sottoposti a uno scambio di sali Na+ prima dell'uso in cellule o animali vivi per garantire che i sali utilizzati nella purificazione siano rimossi.
Esempi di oligonucleotidi antisenso attivi contro la RNasi H | |
|---|---|
| 5′ T*C*C*T*G*C*G*A*A*A*T*G*T*C*C*A*T*C*G*T 3′ | DNA, All PS |
| 5′ T*C*C*TGCGAAATGTCCAT*C*G*T 3′ | DNA, PS/PO chimera |
| 5′ mU*mC*mC*mU*mG*C*G*A*A*A*T*G*T*C*C*mA*mU*mC*mG*mU 3′ | 2′OMe/DNA chimera, All PS |
| 5’ +T+C+C+T+GC*G*A*A*A*T*G*T*C*C+A+T+C+G+T/3Phos/3′ | LNA/DNA chimera, PS/PO chimera, 3′-phos |
* = Phosphorothioate Bonds
mN = 2′-O-Me RNA base
+N = LNA base
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